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CONTAGEM DE MESÓFILOS E PSICROTRÓFICOS EM AMOSTRAS DE LEITE PASTEURIZADO E UHT 1 Count of mesophilic and psychrotrophic microorganisms in samples of pasteurized and ultra high temperature milk Erika K. Saeki 2 Leopoldo S. Matsumoto 3

SU MÁRIO Os a limentos de origem animal, como o l eite, constituem u m importa nte meio de cult ura pa ra o desenvolvimento de micro-orga nismos pa togênicos. Por ser pa ssível de adulterações e contaminações é necessário o monitoramento, a fim de assegurar ao consumidor e a indústria um produto final de boa qualidade. O objetivo deste trabalho foi determinar o nível de contaminação por bactérias mesófilas e psicrotróficas, Staphylococcus sp. e Bacillus cereus em leite pasteurizado e UHT comercializados no município de Bandeirantes, Paraná. Foram analisadas 9 amostras de leite pasteurizados e 9 de UHT, adquiridas aleatoriamente do comércio loca l, tota lizando 18 amostras. O l eite UH T não a presentou conta minação por micro-organismos. Já o leite pasteurizado todas as amostras apresentaram contaminação por mesófilos aeróbios, sendo que três amostras ultrapassaram o valor permitido pela Instrução Normativa N°51, além da elevada contaminação por Staphylococcus coagulase positiva (até 6,11 log10 UFC/mL) e Bacillus cereus (até 5,60 log10 UFC/mL). A alta contagem de mesófilos aeróbios serve de alerta às autoridades de saúde pública para o risco potencial de determinados micro-organismos produtores de toxinas causarem intoxicações alimentares. Termos para indexação: controle de qualidade; microbiologia; saúde pública.

1 INTRODU ÇÃO As doenças de origem alimentar podem ter como causa os agentes quí micos ou mi crobiológicos. Segundo a Organização Mundial da Saúde (2002), estima-se que as pessoas são provavelmente, cem mil vezes ma is suscetíveis a terem uma doença a limentar de origem microbiana do que por resíduos de pesti cida s. No enta nt o, sa be-se qu e os da dos sobre a incidência e as ca usa s de Doenças Transmitidas pelos Alimentos representam apenas u ma fra ção dos ca sos qu e ocorrem (LEITE & WAISSMANN, 20 06). Os alimentos de origem animal ou vegetal, frescos ou processados, incluindo a água, podem veicular micro-organismos patogênicos causadores de toxinfecções alimentares. Dentre os alimentos de origem animal, o leite, pela sua riqueza de nutrientes, constitui um importante meio de cultura para o desenvolvimento de um grande número de

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micro-organismos (BERSOT et al., 2010; BRASIL, 1996). O principal parâmetro utilizado para se verificar a qualidade desse produto é o seu perfil microbiológico, determinado principalmente pela forma de obtenção, armazenamento e transporte. Alguns grupos específicos de micro-or ganismos são frequentemente pesquisados como os aeróbios mesófilos, coliformes e psicrotróficos (TEBALDI et al., 2008; NERO et al., 2009; BECKER, et al. 2010). Um exemplo importante de mesófil o é o gênero Staphylococcus, que é composto por uma variedade de espécies associa das a infecções em seres humanos e animais. Dentre elas destacamse a s espé c ie s S . a u r e u s, S. e p i d e r m id i s, S . sa pro p hyti c u s e S . h a e m ol y tic us (T R AB ULSI et a l . , 1 9 9 9 ). O S t a p h y l o c o c c u s a u re u s e st á pr inc ipa l ment e e nvo lvi do co m d oen ça s i nt r a mamárias de fêmeas em lactação, sendo o principa l a gente ca u sa dor da ma sti te em bovinos, e ta mbém re sp onsá v el pe la pr od u çã o de vá r i a s

Trabalho de Conclusão de curso da primeira autora. Bióloga Mestranda em Ciência de Alimentos –UEL. Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380. Campus Universitário. CEP – 86051-990. Londrina, PR. E-mail: [email protected]. Prof. Dr. da Universidade Estadual do Norte do Paraná – UENP/CLM. Rod. Br. 369 Km 54 – Laboratório de Microbiologia Campus Universitário. CEP – 86360-000. Bandeirantes, PR. E-mail: [email protected].

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tox ina s extr ace l u la r es (S Á et a l. , 2 0 0 4 ). Sã o necessá ri a s a pr oxi ma da men te 6 l og 10 UFC / mL (10 6 UFC/mL) de S. aureus para que a toxina seja a cu mu la da em níveis ca pa zes de provoca r uma intoxicação (JABLONSKY & BOHACH, 1997). A espécie B. cereus tem capacidade de produ zir toxinas responsáveis por intoxicações alimentares, enzimas extracelulares que determinam o potencial de deterioração, e esporos que podem resistir ao tratamento UHT. As toxinas produzidas são classificadas em quatro grupos: enterotoxinas, hemolisinas (cereolisina e hemolisina II), fosfolipase C (fosfatidilinositol hidrolase, fosfatidilcolina hidrolase e esfi ngomieli nase) e toxi na eméti ca (GRANUM, 1994). A presença de Bacillus cereus a pa rtir de 1 0 6 orga ni smos/g em a liment os é indicativo do seu crescimento ativo (GERMANO & GERMANO, 2001). Este micro-organismo tem importância na indústria de alimentos pela capacidade de sobreviver a tratamentos UHT devido a formas esporuladas, que são altamente resistentes ao calor (VIDAL-MARTINS et al., 2006). As doenças alimentares relacionada s a B. cereus manifestam-se, classicamente, sob duas formas clínicas: a síndrome diarr éica e a síndrome emética. A síndrome diarréica possui sintomas como a diarréia intensa e dores abdominais, raramente ocorrendo ná useas ou vômitos. A duração da doença é de 12 a 24 h e o período de incubação va ria ent re 8 a 1 6 h, sendo os a limentos ma is comuns os ricos em proteínas (GRANUM, 1994). A síndrome emética é caracterizada por um período de incubação de 1 a 5 h, seguido por vômitos e náuseas, com 6 a 24 h de duração (MINNARD et al., 2001). A refrigeração do leite tem como objetivo controlar a multiplicaçã o de aeróbios mesófilos. No entant o, a refrigera çã o em torno de 4 -7 °C permite o crescimento de micro-organismos psicrotróficos, que se multiplicam bem nessas tempera tu ra s. O s psicrotrófi cos encontrados no leite são ambientais, provenientes do solo, água, vegeta ção, teto/ú bere e de equ ipamentos de ordenha higieniza dos inadequ adamente. São termolábeis, porém suas enzimas são resistentes ao tratamento térmico (SANTANA et al., 20 01). O objetivo desse trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica do leite pasteurizado e UHT comercializados no município de Bandeirantes – Para ná, identificando Stap hylococc us coa gulase positiva e Bacillus cereus.

do Para ná – Camp us Lu iz Meneghel, dura nte o período de outubro de 2008 a junho de 2009. Foram analisadas 9 amostras de leite pasteurizado e 9 amostras de UHT, totaliza ndo 18 amostras, adquiridas aleatoriamente do comércio local. Os leites pasteurizados foram levados ao laboratóri o sob refrigeração e a s de leite UHT foram ma ntida s em temperatu ra ambiente. Antes de proceder as análises, as embalagens fechadas de leite UHT foram incubadas a 35-37°C durante 7 dias, conforme a recomendaçã o da lei vigente (BRASIL, 1997). 2 .2

Co ntag e m de me sóf ilo s ae ró bio s e psicr o tró fi co s

Realizou-se a técnica de plaqueamento em profundidade (Pour Plate ) em meio Ágar Padrão para Contagem® (PCA). As placas foram incubadas a 35°C/48h e 7°C/10 dias para determinação de mesófilos aeróbios e psicrotróficos, respectivamente (VANDERZANT & SPLITTSTOESSER, 1992). 2 . 3 Co nta g em de St a p hy l oc o c c us c o ag ul ase po siti v a Foi inoculado 0,1 mL em meio seletivo ágar Baird-Parker (BPA) adicionado de emulsão de ovo com telurito de potássio, em placas de Petri previamente preparadas. Após a secagem do inóculo as placas foram incubadas a 35-37°C/24-48h. Para confirmação da espécie foi realizada as provas de DN Ase e ca ta la se (RODR IGUES et al. , 2 00 4 ; STAMFORD et al., 2006). A técnica está relacionada à capacidade deste micro-organismo de reduzir telurito de potássio a telureto, fazendo com que a s colôni a s a presentem coloraçã o negra , e hidrolisar a gema de ovo, produzindo um halo em torno da colônia. 2 .4

Contagem de Bacillus ce reus

Foi semeado 0 ,1 mL de cada diluição em pla ca s contendo Ága r sel etivo pa ra Ba c il lu s c ere us adici onado de polimi xima B e emul sã o gema de ovo. Este material foi incubado em estufa 35°C/18-30 horas. Em seguida, foram submetidos aos testes ágar-gelatina e ágar-amido (AGATA et al., 2002; REZENDE-LAGO et al., 2007).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 2 MATERIAL E MÉTODOS 2 .1 Amo str ag e m A pesquisa foi conduzida no laboratório de microbiologia da Universidade Estadual do Norte

Na presente pesquisa, não houve contaminação por bactérias mesófilas e psicrotróficas em leit e UHT. Apesa r de nã o ter encontra do est es micro-organismos, outros autores tem mencionado bactérias mesófilas, principalmente B. cereus em

Rev. Inst. Latic. “Cândido Tostes”, Nov/Dez, nº 377, 65: 29-35, 2010 le it e UH T ( VI D AL-MART IN S et a l ., 2 0 0 5 ; VI D AL -MA RT IN S e t a l. , 2 0 0 6; REZEND ELAGO et a l., 200 7; B ERSOT et a l., 201 0). De acordo com Paiva et al. (2009), a presença deste pa t ógeno pod e ser resu lta do de c ondi ções higiênico-sanitárias precár ias na ordenha , beneficia mento ou transporte do lei te, enfatizando-se que apesar do tratamento UHT ser capaz de eliminar total mente a forma vege ta tiva do microorganismo, formas esporula das, alta mente resistentes a o ca lor poderã o persist ir e germi nar no produto final se presente no leite antes do tratame nto tér mic o. Os resultados das contagens de micro-organismos mesófil os a eróbios e psicrotr óficos em leite pasteurizado encontram-se na Tabela 1. Os pa drões microbiol ógicos das análises reali zadas foram comparados com os previstos pela Instrução Normativa n°51 de 18 de setembro de 2002 do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento – MAPA (BRASIL, 200 2). Tabela 1 – Contagem de micro-organismos mesófilos a eróbios e psicrotróficos em leite pasteurizado comercializados no município de Bandeirantes, Paraná. Micro-organismos Amost ra 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Mesófilos aeróbios Pscicr ot róficos (log 10 UFC/mL) (log 10 UFC/mL) 1, 6 0 1, 0 0 4, 7 0 0, 6 9 5, 2 0 5, 2 8 5, 3 0 1, 0 0 1, 8 8

1,40 1,00 4,28 1,18 2,00 3,47 3,90 1,00 1,00

De acordo com os limites estabelecidos por Brasil (2002) é permitida a presença de até 4,90 log10 UFC/mL para mesófilos aeróbios em leite pasteurizado. Na presente pesquisa, os resultados variaram de 1 a 5,30 log 10 UFC/mL, sendo que das 9 amostras de leite pasteurizado 3 (33,3%) apresentaram valores acima do permitido, sendo indicativo de leite de baixa qualidade higiênico-sanitária. R esu lta dos semelha ntes a os encont ra dos neste traba lho fora m descritos por R ossi Júni or et al. (2006) que obtiveram valores para microorganismos mesófilos de até 5 log10 UFC/mL em leite pasteuriza do. Silva et a l. (200 8) ao analisa rem 3 4 8 a mostra s de le ite pa st eur iza do, 8 7 (2 5 ,0 %) a prese nt a ra m conta gens de ba ctéri a s mesófilas, acima do permitido pela legislação em vigor. Já Tamanini et al. (2007), ao pesquisarem

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lei tes pa st eurizados encontra m 21 ,15 % fora do padrão exigido pela IN n°51/2002 para mesófilos. Segundo Rossi Júnior et al. (2006) e Silva et al. (2008) os principais fatores que afetam a qualidade do leite pasteurizado são: qualidade do leite cru, ri gor no tra tamento térmico, conta minaçã o póspasteurização e temperatura de estoca gem. Antes da introdução da refrigeração na cadeia do leite, a principal microbiota deterioradora do leite eram as bactérias mesófilas fermentadoras da lactose, que causavam rápida acidificação em leite não refrigerado. O uso da refrigeração associado aos longos períodos de armazenamento selecionou a microbiota psicrotrófica lipolítica e proteolítica (SANTOS et al., 2009). N a presente pesqui sa fora m encont ra dos valores de micro-organismos psicrotróficos entre 1,0 a 4, 28 log 10 UFC/mL (Tabela 1). Cont agens de psicrotróficos a partir de 6 log 10 UFC/mL permitem modificações em leite e derivados, encurtando a vida útil dos mesmos (MAHIEU, 1991). A legislação brasileira não estipula um limite para a população de psicrotróficos, no entanto de acordo com Pinto et al. (2006) não é recomendável a fa bricaçã o de produtos lá cteos a partir do leite cru com conta gem de psi crotróficos superi or a 6,7 log10 UFC/mL. Champagne et al. (1994) relataram que normalmente é preciso que o leite tenha uma contagem acima de 6 log 10 UFC/mL de microrganismos psicrotróficos para que se torne perceptível as mudanças de aroma e sabor do leite. Silva et al. (2008) encontraram contagens de psicrotróficos de até 6 log 10 UFC/mL em seus experimentos. Por sua vez, Rossi Júnior et al. (2006) verificaram contagens de 2 a 3 log 10 UFC/mL no lei te p a ste u riza do e UHT. A prese nça de p sicrotróficos no leite é um fato preocupante, pois o grupo possui a capacidade de produzir enzimas lipolítica s e prot eolíti cas ter moresi stentes, qu e mant ém su a a t ivida de a pós a past eur iza çã o ou mesmo após o tra ta mento por UHT. Problema s relacionados à qualidade dos produtos lácteos como alteração de sabor e odor, perda de consistência e gelatinização ao longo da vida comercial do leite UHT, podem estar associados à ação das enzima s de origem bacteria na (ROSSI JÚNIOR et a l., 2006 ). Os resultados das contagens de S. aureus e B. cereus do leite past eurizado encontram-se na Tabela 2. Apesar de não existir legislação para contaminaçã o por S ta ph y lo co c cu s coa gua lse positiva e Bacillus cereus em leite pasteurizado, toda s a s a mostra s de leite pasteurizado apre senta ra m co nta mi na çõe s p or est es g ru p os de bactérias, variando de 4 a 6,11 log10 UFC/mL para Staphylococcus sp., e de 1 a 5,60 log10 UFC/mL para B. cereus.

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Tabela 2 – Contagem de Staphylococcus coagulase positiva e Bacillus cereus (log10 UFC/ mL) em Leite Pasteurizado comercializados no município de Bandeirantes, Pa ra ná . Micro-organismos Amost ra Staphylo coccus sp. Bacillus cereus (log 10 UFC/mL) (log 10 UFC/mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

4, 1 7 3, 5 4 6, 1 1 4, 0 0 5, 3 0 5, 5 4 4, 3 0 3, 4 8 3, 0 4

3,07 1,00 5,60 0,70 4,20 5,28 5,30 1,00 1,87

A elevada contagem de Staphylococcus sp. é um fator preocupantes para saúde pública, pois concentrações desses micro-organismos va riando entre 5 e 6 log10 UFC/mL são consideradas suficientes para a produção de toxinas prejudiciais a saúde humana (ASSUMPÇÃO et al., 2003). Neste trabalho, o ma ior va lor encont rado foi de 6,11 log 10 UFC/mL, ou seja, possível de ocorrer intoxicação estafilocócica. Em um estudo feito por Borges et al. (2008) foi encontrado valor menor que 1 log10 UFC/mL de Staph ylo co ccu s coagula se positiva pa ra leite pasteurizado. A espécie Staphylococcus sp. destacase pela importância na epidemiologia das doenças veiculadas por alimentos (FAGUNDES & OLIVEIRA, 2004). Entre as fontes de contaminação deste patógeno, os manipuladores de alimentos, portadores de cepas enterotoxigênicas são os grandes responsáveis, sendo as fossas nasa is o principa l r eserva tório (PERESI et al., 2004; GRANDO et al., 2008). Além disso, de acordo com Zecconi; Hahn (2 0 0 0 ), pa ra diminu ir o ri sco d a presen ça do Staphylococcus sp. é necessário implementar medida s pa ra r eduzir a preva lê nci a da s infecções intr ama má ria s (ma stit e) nos bovinos. Esta s i nfecções são frequentes em rebanhos leiteiros, sendo responsável por grandes prejuízos à pecuária leiteira, pois ocasionam redução na produção de le it e , g a st os com me dica men t os e a ssist ênc ia veterinária, além da possibilidade de veiculação deste micro-organismo, toxinas e resíduos de antimi crobia nos no leite (FREITAS et al. , 2 005 ). Verificou -se a presença de B. ce reu s com concentrações de até 5,60 log10 UFC/mL, demonstrando a necessida de de ma ior controle na produçã o de lei te. A presença de Bacillus cereus a partir de 6 log 10 UFC /mL em a lime ntos i ndica cresci mento at ivo do micro-orrga nismo e é u m

risco potencial a saúde (GERMANO & GERMANO, 2001). As intoxicações alimentares iniciam quando o alimento é sujeito a abusos de tempo-temperatura, propiciando que um nível baixo de organismos se multiplique até níveis (> 5 log10 UFC/mL) significativos (SOTO et al., 2005). Em trabalhos semelhantes, R ezende-Lago et al., (2007) e Vidal-Martins et al., (2006) encontraram 96,7%, 91,7%, respectivamente, de amostras positivas para B. cereus em leite pasteurizado. A ausência de contaminação em leite UHT é de extrema importância, devido ao seu crescente consumo nas últimas décadas. Esta participa ção elevada do leite UHT na comercialização de leites fluídos no Brasil é devido, principalmente a sua pra ti cidade e ma ior vida de pr a teleira (R OSSI JÚNIOR et al., 2006; BERSOT et al., 2010). 4 C O N C LU S Õ E S Os resultados obtidos neste trabalho servem de alerta à s autoridades de saúde pública para o risco potencial de determinados micro-organismos produtores de toxinas causarem intoxicações alimentares, justificando, assim, a criação de programas efetivos de controle e prevenção destes agentes. A contaminação por mesófilos, psicrotróficos, Staphylococcus coagulase positiva e Bacillus cereus em leite pasteurizado são fatores preocupantes já que este tipo de leite é utilizado como ma t éria -prima de ou tr os produtos a li mentíci os como para a fabricação do queijo. Estes resultados provavelmente são decorrent es da qu alida de do leite cru, deficiênci a da pa steu ri za çã o ou conta mi naç ão pós-processa ment o, sendo o homem a gente t ra nsmissor de maior importância. Isso deve servir de alerta aos responsáveis t écnicos pa ra que sejam anali sados os procedimentos padrões de higiene dos empregados nas propriedades e na indústria. A fim de evitar que a população consuma leite de má qualidade. Os Leites UHT a nalisa dos nã o apresent aram contaminantes microbianos, o que demonstra eficiência na sua produção e também a utilização de leite cru de boa qualidade. SUMMARY Foo d of a nima l or veg eta bl e ori gin ca n serve vari ous pa thogenic microorga nisms. T he fo od of a nima l ori gin , mil k co nst i tu t es a n important medium of culture for the development of a la rge number of microorgani sms. It is a lso su scepti bl e to t a mp eri ng a nd cont a mina ti o n, which mak es qu al ity monitori ng a necessi ty, to en su r e a n a deq ua t e fina l pr odu ct bot h t o t he co nsu mer a nd in du stry. T his st u dy a i med to de ter min e th e l eve l o f c ont a mi na t i on of

Rev. Inst. Latic. “Cândido Tostes”, Nov/Dez, nº 377, 65: 29-35, 2010 pasteurized and UHT milk by psychrotrophic and mesophilic, Staphylococcus sp. and Bacillus cereus. Were a na lyzed 9 sa mples of pa st eur ized a nd 9 sa mples of UHT milk, ra ndomly purchased from superma rket, tota ling 18 samples. The UH T milk sho wed n o c o nt a mi na t i o n b y mi c r oo r ga ni sms, p a st eu r iz e d m il k w a s co n ta mi na t e d b y mesophiles, and in three of the samples exceeded t he a mou n t a l l o we d b y l a w; a n d a hi g h contamination by St aphylo coccus sp. (until 6, 11 log 10 UFC /mL) a nd Ba cil lus c e re us (u nti l 5, 6 0 log 10 UFC/ mL). T he high cou nt s of me sop hil ic ser ve t o a l e r t p u bl i c he a lt h a u th or i t i es t o t h e po ten tia l r isk o f c ert a in ba cte ria t ha t pr odu ce toxins ca using outbrea ks. Index terms: quality control, microbiology, public health. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AG ATA, N . ; O H TA , M .; YO KO YAMA , K. P ro d uc ti o n o f B ac i ll u s c e r e u s eme ti c t oxi n ( ce r eu de ) i n va ri o us fo ods. I nt e r n at i o na l J ou r n al o f Fo od M i c r o b io lo g y , v. 7 3 , p . 23 2 7 , 2 0 0 2. ASSUMPÇ ÃO , E. G.; PIC COLI-VALLE, R . H .; HIRSCH, D.; ABREU, L. R. Fontes de contaminação por St a p hy lo c o c c u s a ure u s na linha de processa ment o de qu eij o pra t o. Arquiv o Br asil e iro de M e dic ina Ve te r inár ia e Zoote cnia, v. 55, n. 3, p. 36 6-370, 2 003. BECKER, T. A.; NEGRELO, I. F.; RACOULTE, F.; DRUNKLER, D. L. Avaliação da qualidade sanitária de leite integral informal, pasteurizado, UHT e em pó comercia li za dos na cida de de Media neir a e Serra nópolis do Igu a çu – Pa ra ná . Se mi na: Ciências Agrárias, Londrina, v. 31, n. 3, p. 70771 6, 2 01 0. BERSOT, L. S.; GALVÃO, J. A.; RAYMUNDO, N. K. L.; BARC ELLOS, V. C.; PI NTO, J. P. A. N .; MAZIER O, M. T. Ava li a çã o microbiol ógi ca e físico-química de leites UHT produzidos no Estado do Paraná – Brasil. Sem ina: Ciênc ias Agrárias, Londrina, v. 31, n. 3, p. 645-652, 2010. BRASIL. Regu lame nto de Inspeção Indu stria l e Sanitária de Produtos de Origem Animal, aprovado pelo Decr eto n ° 3 0 .6 9 1 , de 2 9 /0 3 /5 2 , a lt era do pelo decreto n° 1.255, de 25/06/62, alterado pelo decret o n° 1 . 8 12 , de 0 8/0 2 /9 6 . Diár io O fi c ial da União , B rasíl ia , 09/ 0 2/ 9 6, seçã o I, p.2 2 4 12 24 3, 1 996 . BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria n. 415, 19 de setembr o de 1 9 9 7 . R egul a mentos T écnicos.

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